Biotecnología en el Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas
Ejemplos cortos de ensayos: Inmunoensayos y sus aplicaciones.
Los inmunoensayos se utilizan para detectar proteínas específicas de agentes patógenos, o respuestas de anticuerpos contra dichas proteínas. Se basan en interacciones inmunitarias antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) y por ello la producción de antígenos recombinantes mediante técnicas de ingeniería genética, así como la de anticuerpos monoclonales han supuesto una importante mejora cualitativa que ha permitido obtener unos índices de sensibilidad y especificidad hasta ese momento impensables. Los antígenos más adecuados son las proteínas en estado natural, puesto que proporcionan epítopos estructurales nativos, sin embargo, tienen que obtenerse a partir de cultivos celulares, son complicados de producir y caros, con periodos de validez cortos y pueden presentar problemas de infectividad por una inactivación incompleta. En la actualidad, se utilizan con frecuencia proteínas recombinantes las cuales ofrecen muchas ventajas respecto a los antígenos aislados de otras fuentes biológicas, como son: pureza, una gran actividad específica y estandarización entre lotes. Al igual que en el caso de las vacunas, los antígenos recombinantes se pueden obtener a partir de distintos sistemas (E. coli, levaduras, células de insecto, etc.). Recientemente, el uso de plantas transgénicas para expresar proteínas de patógenos animales ha demostrado ser un método eficaz para la producción de grandes cantidades de proteínas recombinantes evitando el uso de materiales de origen animal como suero bovino fetal o huevos.
Con respecto a la producción de anticuerpos monoclonales (AcMs), la vía clásica de obtención se basa en la inmortalización de células productoras de anticuerpos (hibridomas) mediante fusión celular para producir un anticuerpo de una clase, especificidad y afinidad determinada (Koehler y Milstein, 1975). Una vez obtenidos estos hibridomas, se asegura el suministro indefinido, homogéneo y estable del AcM que producen, con sus características de especificidad y afinidad intactas. Esto supone una gran ventaja en la estandarización de métodos de diagnóstico que usan AcM.
Actualmente, las nuevas tecnologías permiten obtener anticuerpos específicos sin la inmunización de animales. La técnica “Phage display” se está utilizando para seleccionar péptidos, proteínas o anticuerpos en colecciones de fagos en cuya superficie exponen estos elementos (Smith y Petrenko, 1997). Como alternativa a la utilización de AcM, existen a su vez los Aptámeros (Tuerk y Gold, 1990; Ellington y Szostak, 1990). Se trata de cadenas sencillas de oligonucleótidos sintéticos (ADN o ARN) identificados a través de un proceso combinatorial denominado SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment; cf. Stoltenburg, Reinemann y Strehlitz, 2007). Estas secuencias presentan una alta afinidad y especificidad por la diana de interés (antígeno viral, bacteria, etc.) mostrando características similares a los anticuerpos pero con mayor resistencia y estabilidad. Las herramientas diagnósticas basadas en aptámeros posiblemente serán de gran interés en el futuro para desarrollo de biosensores, etc.
El límite para diferenciar entre inmunoensayos “clásicos”, y aquellos “basados en biotecnología” no está claramente definido. Los inmunoensayos convencionales o clásicos se han basado en la detección de anticuerpos frente a un patógeno de interés utilizando, entre otras, las técnicas de neutralización viral en cultivos celulares, fijación de complemento, inmunodifusión en gel de agar o ensayos inmunoenzimáticos (ELISA). Los ensayos ELISA han sido una de las grandes aportaciones al diagnóstico inmunológico de las enfermedades infecciosas. En una muestra determinada se puede evaluar tanto la presencia de un patógeno como de anticuerpos frente a él. Posee innumerables aplicaciones en sanidad animal y, hoy en día, continúa siendo una de las técnicas más utilizadas en todas sus versiones: ELISA indirecto, de competición y de doble reconocimiento (DR), para detección de anticuerpos específicos en una muestra, y ELISA tipo sándwich para la detección de antígeno. Ejemplos de estos inmunoensayos son el ELISA de detección de Anaplasma (Trueblood, McGuire y Palmer, 1991), del virus de la Diarrea Viral Bovina (Mignon et al., 1991) y del virus de la Peste Bovina y del virus de la Peste de los Pequeños Rumiantes (Libeau et al. 1994) para detección del patógeno. Respecto a los ELISAs de detección de anticuerpos, han tenido gran importancia los ensayos DIVA utilizados en la erradicación del virus de la Pseudorabia en porcino (Ma et al., 2008) o en la erradicación de la Influenza Aviar de baja patogenicidad en aves domésticas (Marangon et al., 2003) entre otros.
Los “nuevos” inmunoensayos, además de mejorar la sensibilidad y la especificidad del diagnóstico, tienen dos objetivos principales: En primer lugar, la detección múltiple de analitos (antígenos o anticuerpos) en un solo ensayo utilizando poco volumen de muestra. Un ejemplo de esta aproximación es la tecnología denominada Luminex, que implica la inmovilización de diferentes moléculas (antígenos o anticuerpos) en microesferas de poliestireno marcadas con distintas proporciones de dos colorantes fluorescentes sensibles a luz infrarroja (existen hasta la fecha 100 tipos de microesferas). Con esta técnica es posible analizar distintos parámetros en una muestra y en un solo pocillo, identificando cada uno de ellos de manera independiente. En el campo de la sanidad animal, se está trabajando en el desarrollo de ensayos para la detección simultánea de distintos patógenos entéricos o para detección y diferenciación de anticuerpos específicos frente a distintos serotipos de un virus o virus de la misma familia. Otra aproximación son los denominados micromatrices o microarrays, cuya superficie (vidrio, propileno…) está recubierta con analitos perfectamente ordenados con los que interaccionan las proteínas de la muestra. Un equipo especial, permite localizar con quién y con qué intensidad ha tenido lugar esa interacción. Inicialmente se desarrolló para detección de material genético, pero puede ser utilizada para la detección de proteínas y anticuerpos. Actualmente se utilizan con fines de investigación, pero es previsible que en un futuro próximo puedan llegar a ser de gran utilidad en diagnóstico.
En segundo lugar, hoy en día son cada vez más demandadas las técnicas diagnósticas que puedan realizarse fácilmente y en el sitio donde se localiza el problema (granja, clínica, mataderos, etc.). Es lo que se conoce como ensayos “Portable, Field, On-site, Pen-side o Point-of-care”. El objetivo es, que se puedan tomar decisiones rápidas, que reduzcan los costes de diagnósticos más complejos y la diseminación de la enfermedad. Son fundamentales en países poco desarrollados, donde el transporte de las muestras a los laboratorios puede suponer mucho tiempo. La técnica inmunológica más ampliamente utilizada para este propósito es la inmunocromatografía (Figura 2). Está basada en el transporte de reactivos por capilaridad a través de una membrana porosa que permite detectar el complejo antígeno-anticuerpo de manera visual sin necesidad de equipo alguno proporcionando sensibilidad y rapidez en el diagnóstico. Son dispositivos de fácil manejo, con formato sencillo, muy estables, no necesitan refrigeración y son económicos. Se aplican en la detección de virus, bacterias, parásitos, hormonas y anticuerpos específicos de diferentes patologías. En la actualidad existen una gran variedad de ensayos comercializados para animales de compañía y de granja, y están siendo cada vez más demandados por los veterinarios.
Bibliografía
- Rodríguez García, J., Ranz Casares, A., Barreiro Morán, B., Delbecque Peña, J., Sanz Fernández, A., & Rueda Pérez, P. (2014). LA BIOTECNOLOGÍA EN SANIDAD ANIMAL. Ingenasa (Inmunología y Genética Aplicada S.A.), 190(768). Recuperado el 13 de 07 de 2019, de http://arbor.revistas.csic.es/index.php/arbor/article/view/1956/2284
