Clasificación Y Características De Los Medios De Cultivo Para El Crecimiento De Los Microorganismos Fúngicos

Componentes generales de los medios de cultivo

Los hongos crecen, variando su morfología y comportamiento fisiológico según los elementos nutritivos que le proporcionamos. En general los medios de cultivo poseen Agar para medios sólidos (siendo un elemento de soporte), algún hidratos de carbono como fuente de energía (glucosa, lactosa, otros), extractos (carne, cerebro, corazón, hígado, otros), peptona como fuente de nitrógeno, agua de chorro (que proporciona minerales) o agua destilada, indicador de pH, agentes selectivos (antibióticos, antifúngicos, otros) y un sistema amortiguador. Cada medio de cultivo posee una receta única donde se le añaden una cantidad establecida de ciertos componentes antes mencionados y se le restringe de otros, dependiendo del fin que necesitamos.

Clasificación de los medios de cultivo

Los medios de cultivo pueden ser clasificados de muchas maneras pero en esta oportunidad serán abordados según su consistencia, composición y función, en los cuales se destacan:

Según su consistencia:

• Líquidos: Se les conoce comúnmente como caldos, poseen todos los componentes en una solución acuosa.
• Sólidos: Se prepara añadiendo agar al caldo, este agar es una sustancia extraída de las algas y es totalmente inerte cuya consistencia es gelatinosa sólida y no es digerida por los microorganismos.
• Semisólidos: Tiene una proporción caldo/agar establecida para obtener esta consistencia.

Según su composición y función:

• Generales: son medios diseñados para el crecimiento de la mayoría de los microorganismos fúngicos. En micología el más conocido es el Agar Sabouraud Dextrosa (SDA) por su fácil preparación, se utiliza cotidianamente y es un medio base para el aislamiento y crecimiento de agentes fúngicos provenientes de muestras clínicas para una futura identificación.
• Selectivos: Son medios que permiten el crecimiento de los hongos patógenos que afectan al ser humano y que son de importancia para el estudio en los casos clínicos, estos se debe a que permiten el crecimiento de los agentes fúngicos patógenos e impiden el crecimiento de la mayoría de hongos ambientales y bacterias que no tienen importancia clínica. Esto se logra porque en su composición poseen sustancias inhibidoras como lo son los antibióticos, en el caso de antifungicos tenemos la Actidiona y en los casos de antibacterianos tenemos Cloranfenicol y Gentamicina que son los más usados. En este caso el medio conocido por excelencia y que proporciona buenos resultados es el Agar Micosel.
• Enriquecidos: Son medios utilizados para ciertos microorganismos que exigen ciertos sustratos adicionales para poder desarrollarse y crecer (estos medios no necesariamente inhiben el crecimiento de los demás hongos). Aquí tenemos como ejemplo el Agar Infusión Cerebro Corazón (BHI) que permite un buen aislamiento en el caso de los hongos causantes de micosis profunda como es el caso de la histoplasmosis.
• Diferenciales: son medios que permiten diferenciar y clasificar diversos hongos en género o especie debido a la presencia de sustancias comógenas o indicadores de pH, evidenciando las características que presenta cada uno de estos microorganismos fúngico. Por ejemplo el Agar Cromogénico para Candida que permite su crecimiento y a su vez diferenciar diversas especies de este patógeno, según el desarrollo o producción de un pigmento (color) específico cuando crece en este agar.
• Especiales: Son medios diseñados específicamente para el crecimiento de un género o especie de hongos. Un ejemplo claro es el medio Converse para obtener la fase levaduriforme de Coccidioides spp. debido a que tiene especificaciones únicas para poder obtener el crecimiento de este hongo.
• Medios caseros de Borelli: Son medios cuya forma de preparación se basan en utilizar nutrientes de “casa” como zanahoria, papa, maíz, cambur, miel, leche, harina de trigo, avena y otros que sean de uso cotidiano. Estos medios son útiles porque brindan al microorganismo los sustratos necesarios para favorecer la esporulación y producción de conidias que son parte de su morfología, siendo importantes e indispensables para la identificación de los hongos. Como ejemplo tenemos el medios Lactrimel que posee principalmente Leche, harina de trigo y miel de abeja.

En todos se deben proporcionar las condiciones ideales que requiere cada microorganismo: Temperatura, pH, O2, CO2, otros.

Nota: hay medios que pueden presentar varias de las formas antes expuestas al mismo tiempo, es decir, pueden ser, enriquecidos y diferenciales o enriquecidos y selectivos, entre otros.

Presentación de los medios de cultivo

Cultivo en tubo:

Es un método utilizado en los laboratorios de micología, donde se utilizan tubos cuyo diámetro y tamaño dependen de la necesidad del Bioanalista o Investigador. En estos tubos se verte el agar preparado que esta fase líquida, se lleva al autoclave por un tiempo determinado para esterilizar, luego se coloca a temperatura ambiente de manera inclinada para que se forme una especie de bisel, una vez que esté solidificado y que haya cumplido con el protocolo de esterilidad, se utiliza para sembrar muestras clínica o trozos de material fúngico para luego evidenciar el crecimiento del microorganismo.

Cultivo en Placa de Petri:

Es un método utilizado en los laboratorios de micología, donde se utilizan placas de Petri, en este caso a diferencia del método en tubo, se debe esterilizar el agar en la autoclave antes de servirlo en las placas, al momento de verter el material en cada recipiente se trabaja en la campana de extracción para mantener la esterilidad, se espera que este solidificado y que haya cumplido con el protocolo de esterilidad para luego proceder a sembrar las muestras clínicas o un trozo de material fúngico y esperar para evidenciar el crecimiento.

Nota: El medio de cultivo en tubo es mucho más seguro que en placas de Petri debido a la forma reducida de la boca de los tubos y su fácil manipulación al ser comparado con las placas de Petri que son más fáciles para abrirse y mucho más difíciles de manejar, esto hace que aumente las posibilidades de accidentes laborales al diseminarse material fúngico en el ambiente del laboratorio.

Nota: Debido a la escasez de materiales en el país se ha tomado otro tipo de envases para la elaboración de los medios de cultivo con diversas formas que sean cómodas y facilite el trabajo en el laboratorio, teniendo en cuenta que deben ser de fácil manipulación y que cumplan con las normas de bioseguridad y esterilidad.

Microcultivo

Hay otras variantes sobre el uso del agar cuando ya se tiene preparado, el microcultivo conocido también como cultivo en lámina, es una técnica de gran utilidad en la micología clínica y consiste en sembrar al hongo en una pequeña porción del medio de cultivo que este sobre una lamina portaobjeto, esto se realiza con la finalidad de obtener la esporulación del microorganismo sembrado, y así evidenciar las estructuras fúngicas intactas sin alterar el arreglo de sus conidias, para que cuando sean observadas al microscopio, se pueda llegar a la identificación del microorganismo de manera más precisa y eficiente. De los microcultivos se destacan dos métodos tradicionales que son:

• Método de Ridell o del cuadrito: se corta un cuadrito entre 1-1,5cm de agar y se coloca sobre una lámina portaobjeto, se toma un repique (un trozo pequeño) del hongo que se quiere identificar y se siembra en los cuatro costados del cuadrito, luego se le coloca una laminilla en la parte superior como especie de una tapa.
• Método de Rivalier o de la gota: en este caso se funde el agar sólido aplicando calor y con una pipeta Pasteur estéril se toma un poco del agar y se van agregando gotas sobre gota, esto teniendo en cuenta un intervalo de tiempo entre cada gota, donde se permita que la anterior haya solidificado, de manera que queden varias capas con cada gota, una vez sólido se procede a sembrar el hongo a identificar sobre esta superficie de agar.

Nota: ambos se realizan en una Placa de Petri, con un soporte interno para la lámina portaobjeto, y se le agrega agua estéril, sin que la cantidad de la misma sobrepase el soporte, y así mantener húmedo el ambiente. Todo esto debe estar estéril.

Utilidad e importancia clínica de los medios de cultivo

Los medios de cultivo permiten aislar de muestras clínicas un agente fúngico al proporcionar los elementos necesarios para su desarrollo y buen crecimiento, permitiendo así la correcta identificación tanto de género como de especie del agente patógeno y posteriormente poder aplicar el tratamiento necesario de manera oportuna para eliminar ese agente infeccioso del paciente lo más pronto posible.

Preparación de medios de cultivo

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados; normalmente bajo la forma de liofilizados a los que es preciso rehidratar. En estos casos la preparación del medio de cultivo se reduce sencillamente en pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles, se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes después de que estos hayan sido previamente esterilizados en el autoclave y enfriados a temperatura ambiente ó a 40-50ºC si se trata de medios con agar.