Métodos De Aislamiento En Las Proteinas De Membrana

Introducción

Para las proteínas de membrana no existe un método universal de aislamiento y purificación, ya que es la fuerza con la que se encuentre unida a los lípidos de membrana la que determine que procedimiento seguir. Mientras que unas se pueden extraer únicamente con disoluciones de elevada fuerza iónica (NaCl 1M) otras necesitan de detergentes y disolventes orgánicos para su separación, factor que indica como de íntima es la unión proteína-lípido. 

El importante papel que juegan estas proteínas en la fisiología de las células, y por tanto, de los organismos causa un fuerte interés en la biología molecular, por lo que el estudio y caracterización de su estructura tridimensional es el objetivo de muchos investigadores. Conocer su estructura implica, por tanto, ahondar en su mecanismo de acción, información que puede ser útil en muchos campos como el de la biomedicina. 

La cristalografía y la difracción de rayos X como herramienta para resolver la estructura de las proteínas es actualmente la más extendida en la biología molecular de las proteínas debido a los resultados que proporciona al PDB. Tiene una gran utilidad, sin embargo, cuando hablamos de proteínas de membrana nos encontramos que hay muy pocas estructuras resueltas. Esto se debe a que para conseguir los cristales nos encontramos con una serie de problemas y limitaciones que debemos abordar y que complican aún más el proceso, por tanto es uno de los mayores retos de la cristalografía actual. 

Desarrollo

Como ya hemos explicado anteriormente, las proteínas de membrana se encuentran embebidas en la membrana plasmática, es el medio que les aporta estabilidad. Esto implica que en su estructura podemos distinguir una parte hidrofóbica, por lo que hay que buscar alternativas a las soluciones utilizadas en la cristalización de las proteínas hidrosolubles. La purificación de las proteínas de membrana es un punto clave y crítico del proceso, ya que conseguir soluciones de proteínas de membrana estables fuera de la membrana plasmática que favorezca la formación de cristales es el primer reto al que nos enfrentamos. 

Primeras aproximaciones

Crambina: Es una proteína de membrana de pequeño tamaño, unos 46 aminoácidos, y gran estabilidad debido a la presencia de puentes disulfuro. Fue aislada por primera vez de las semillas de una brassicaceae, Crambe hispánica subesp. Abyssinica (6). Su estructura fue resuelta por Wayne A. Hendrickson y Martha M. Teeter en 1981 utilizando el método de la dispersión anómala simple (7). Es una proteína modelo para el estudio de proteínas de membrana. La estrategia que se utilizó para la cristalización fue la utilización de un disolvente orgánico, el etanol. Sin embargo, es una estrategia que no sirve para una gran mayoría de proteínas de membrana debido no pueden estar estables en disolventes orgánicos (4). 

Hemaglutinina: Es una proteína de membrana encontrada en el virus de la gripe que le permite localizar e infectar células hospedadoras (8). Está claramente diferenciada por 

dos diferentes partes, la cola, que se encuentra en el interior de la membrana y una cabeza de tipo globular, que contienen los diferentes antígenos y receptores necesarios para su mecanismo de acción. Su estructura fue resuelta en 1981 por Wilson et al. Para cristalizar esta proteína se llevó a cabo una proteólisis de la región hidrosoluble. El inconveniente de este método es que no se puede cristalizar y por tanto resolver la estructura de la región transmembrana. 

Receptor de la insulina: Es una proteína de membrana que tiene un papel fundamental en el metabolismo de los seres vivos, ya que permite que la insulina pueda activar o inhibir diferentes rutas de señalización dentro de la célula. Se trata de una proteína de membrana del tipo tirosina-kinasa que se caracteriza por tener una porción dentro de la membrana plasmática y otra extracelular. Como en el ejemplo descrito anteriormente para cristalizar esta proteína se lleva a cabo una proteólisis de la región hidrosoluble, que es de la que se resuelve la estructura. En esta proteína además se incorporó el uso de la ingeniería genética para eliminar esta primera fase de proteólisis mediante la expresión de la región hidrosoluble en células hospedadoras. 

Protocolo de actuación actual

En primer lugar es importante seleccionar la proteína a estudiar y clonar dentro de un sistema de expresión conveniente para amplificar. Una vez obtenida una cantidad considerable para llevar a cabo los experimentos hay que purificar la proteína, lo que supone uno de los pasos más críticos de la cristalización de las proteínas de membrana. Por último, se deben considerar las variables necesarias para crear una estrategia que permita obtener los cristales de la macromolécula. 

Papel de los detergentes

La estrategia más extendida en la cristalización de proteínas de membrana es el uso de los detergentes. Son moléculas de carácter anfipático formadas por una cabeza polar y un tallo o cola hidrofóbica. Según como sea la cabeza hidrofílica podemos distinguir detergentes iónicos, noniónicos o zwitterionicos. Dependiendo de su estructura el detergente tendrá un determinado comportamiento. Actúan imitando a las membranas celulares en las que están insertadas las proteínas de manera que forman agregados o complejos con las proteínas de membrana en forma de micelas que se pueden solubilizar en una solución a la que se le añade agente precipitante. 

Tipos de cristales

Las proteínas de membrana forman cristales de tres tipos principalmente: cristales 2D, 3D tipo I y 3D tipo II, siendo los dos últimos tipos nombrados los que interesan para los estudios de difracción de rayos X. 

• Cristales tipo I: Se caracterizan por las interacciones hidrofóbicas entre proteína-detergente-lípido. Cristalizan siguiendo el método in meso o también llamada la fase cúbica lipídica. Consiste en la cristalización de las proteínas de membrana dentro de una bicela que crea un medio estable para que los cristales puedan crecer en las tres dimensiones del espacio. Las bicelas son unos discos que imitan a las membranas plasmáticas en las que podemos distinguir lípidos y molécula anfipática (detergente).
•  Cristales tipo II: Podemos destacar la presencia de las interacciones entre las regiones hidrofílicas de las proteínas. Cristalizan siguiendo el método in surfo que consiste en tratar al compljo proteína-detergente como una proteína soluble. Esta técnica da lugar a la formación de micelas y la elección del detergente es crucial, ya que determinará como de buena será la difracción. 

Conclusión

Las proteínas de membrana son uno de los grandes retos en el campo de la cristalografía debido a la gran cantidad de inconvenientes que presentan. El aumento de las variables a tener en cuenta así como la imposibilidad de disolverlas en las soluciones utilizadas para las proteínas hidrosolubles son algunas de las complicaciones a las que nos enfrentamos cuando queremos cristalizarlas. Sin embargo, el creciente interés que presentan en ámbitos como la farmacología hace que se creen nuevas estrategias y métodos útiles que permiten poco a poco superar las barreras que se presentan permitiendo así conocer y aumentar el número de estructuras resueltas.