Transformación Bacteriana de E. Coli Utilizando el Plásmido pUC19 para la Expresión de Genes

Introducción

La transformación genética es el proceso por el cual una bacteria fusiona o une material genético libre, conocido como exógeno, a través de la membrana celular. Una transformación genética tendrá éxito si la célula bacteriana es competente. Sin embargo, la naturaleza competente de una célula bacteriana no representa una limitación, ya que es posible inducirla por mecanismos físicos o químicos. Entre los mecanismos físicos se encuentra electroporación y sonicación, los cuales involucran aplicación de energía, estos tienden a ser más efectivos y sencillos que los mecanismos químicos (Serrano, 2013). Por otro lado, entre los mecanismos químicos se encuentra CaCl2. El proceso de transformación de CaCl2, incluye un choque térmico que reduce el movimiento de las moléculas en las membranas bacterianas permitiendo el paso del ADN exógeno y a su vez cerrando el poro de adhesión, promoviendo la inserción del plásmido a la célula; el CaCl2 ayuda a neutralizar las cargas negativas en las membranas y así permite el acercamiento del ADN.

Los plásmidos son estructuras capaces de replicarse dentro de las células independientemente de su ADN cromosómico. Estos son utilizados como vectores que proveen ciertas características a las células en las cuales se replican. Existen plásmidos denominados plásmidos de resistencia. Entre ellos se encuentra el pUC19, este plásmido confiere resistencia a los antibióticos ampicilina y a tetraciclina.

Escherichia coli es una bacteria gram negativa no competente, es decir en su naturaleza no es posible incorporar material exógeno. Escherichia coli desarrolla una alta competencia genética solo en condiciones artificiales, incluida la exposición a altas concentraciones de Ca2 + y al choque térmico… (Hasegawa, 2018). Como objetivo experimental de este estudio se encuentra lograr que las células bacterianas de Escherichia coli adquieran material genético exógeno, pUC19, y que expresen genes del mismo.

la transformación genética es el proceso por el cual una bacteria fusiona o une material genético libre, conocido como exógeno, a través de la membrana celular. Una transformación genética tendrá éxito si la célula bacteriana es competente. Sin embargo, la naturaleza competente de una célula bacteriana no representa una limitación, ya que es posible inducirla por mecanismos físicos o químicos. Entre los mecanismos físicos se encuentra electroporación y sonicación, los cuales involucran aplicación de energía, estos tienden a ser más efectivos y sencillos que los mecanismos químicos (Serrano, 2013). Por otro lado, entre los mecanismos químicos se encuentra CaCl2. El proceso de transformación de CaCl2, incluye un choque térmico que reduce el movimiento de las moléculas en las membranas bacterianas permitiendo el paso del ADN exógeno y a su vez cerrando el poro de adhesión, promoviendo la inserción del plásmido a la célula; el CaCl2 ayuda a neutralizar las cargas negativas en las membranas y así permite el acercamiento del ADN.

Los plásmidos son estructuras capaces de replicarse dentro de las células independientemente de su ADN cromosómico. Estos son utilizados como vectores que proveen ciertas características a las células en las cuales se replican. Existen plásmidos denominados plásmidos de resistencia. Entre ellos se encuentra el pUC19, este plásmido confiere resistencia a los antibióticos ampicilina y a tetraciclina.

Escherichia coli es una bacteria gram negativa no competente, es decir en su naturaleza no es posible incorporar material exógeno. Escherichia coli desarrolla una alta competencia genética solo en condiciones artificiales, incluida la exposición a altas concentraciones de Ca2 + y al choque térmico (Hasegawa, 2018). Como objetivo experimental de este estudio se encuentra lograr que las células bacterianas de Escherichia coli adquieran material genético exógeno, pUC19, y que expresen genes del mismo. INCOMPLETO-(info y no he incluido las refrencias)

Materiales y Métodos

El experimento fue realizado en uno de los laboratorios de genética del Recinto Universitario de Mayagüez. El propósito de este experimento es apreciar la transformación de E. Coli con la ayuda de un plásmido. Se comenzó el experimento colocando en hielo los plásmidos y el Cloruro de Calcio. Luego, se añadieron 250µl del Cloruro de Calcio de 50 mM con la ayuda de una micro-pipeta a un micro-tubo. A continuación, se volvieron a colocar los tubos ya rotulados en hielo. Con la ayuda de un mechero se esterilizó una aguja de inoculación, para así tomar tres colonias de un cultivo fresco de E.Coli. Próximamente, se añadieron las colonias a cada micro-tubo. Para así añadir 10µl al plásmido (10ng) que corresponde a PUC (+). Se dejaron reposar en hielo por un lapso de 5 minutos. Uno de los pasos más importantes fue dejar el micro-tubo a baño María para así incubarlos a 42⁰C por exactamente 50 segundos. De manera inmediata, los micro-tubos pasaron al hielo, nuevamente y reposaron por aproximadamente 5 minutos. Se añadieron 250µl de LB caldo y fueron reposados en la incubadora a 37⁰C por un lapso de 30 minutos. Se tomaron 150 µl de PUC+ y se añadieron al plato correspondiente. Luego, los platos fueron sellados con parafinas y llevados a la incubadora a 37⁰C por las próximas 24 horas.

Resultados

El plato Petri que contenía LB mostró crecimiento bacteriano. En el plato con LB y ampicilina se observó crecimiento de un contaminante, sin embargo no hubo el crecimiento bacteriano esperado. En el plato con LB, ampicilina y X-gal( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidasa) no hubo crecimiento alguno.

Discusión y conclusión

La práctica del experimento consistió en manipular células de la bacteria Escherichia coli para que adquirieran material genético exógeno y expresaran genes que pertenecen al material incorporado, estos siendo los genes de Amp y lacZ’. El plato Petri con LB mostró crecimiento bacteriano, sin embargo, por la morfología de las colonias se cree Escherichia coli no fue la única bacteria en el medio. Por lo tanto, las colonias amorfas sugieren que hubo contaminación. Una posible razón de esto es que no se tuvo el mechero encendido al transferir el LB, por lo que se cree que microorganismos del ambiente contaminaron el LB. En el plato con LB y ampicilina  no hubo crecimiento bacteriano, lo cual sugiere que E. coli no incorporó el plásmido pUC19. Dicho plasmido contiene el gen amp, el cual le confiere la resistencia a ampicilina. En oposición a lo esperado, se observó crecimiento de una levadura, la cual debe ser resistente a ampicilina. Por falta de materiales, se utilizó una cantidad menor de CaCl2 a la esperada, lo cual pudo ocasionar la transformación no exitosa ya que la función del CaCl2 era lograr la entrada del plásmido a las células. En un próximo laboratorio de transformación, se podría controlar la concentración del CaCl2, ya que, en un estudio realizado por Lim, Lum y Sam (2015), se observa que la concentración de CaCl2 en la cual E. coli demostró la máxima eficiencia de transformación para el plásmido fue a 0.15M y en este experimento se utilizó CaCl2 50mM. Además, la gel parece estar derretida, por lo que es posible que la aguja de inoculación estaba demasiado caliente al hacer el estriado e inhibió la proliferación de Escherichia coli. En su experimento, Noor et. al (2013) confirman que a medida que aumenta la temperatura, el crecimiento de colonias de Escherichia coli disminuye. Por lo tanto, la aguja de inoculación caliente es una posible explicación para la falta de crecimiento de la bacteria en el medio. Por último, el plato con LB, ampicilina y x-gal  tampoco mostró crecimiento bacteriano. Al igual que en el plato anterior, esto se puede explicar por la falta de CaCl2. Si las células de Escherichia coli hubiesen sido transformadas de manera exitosa, se hubiesen observado colonias azules ya que cuando x-gal entra en contacto con beta-galactosidasa se genera un producto azul. Sin embargo, como no se observó este color en colonias, confirma que el gen lacZ del plásmido no se expresó. Además, la ausencia de colonias blancas sugiere que las células tampoco adquirieron el gen de resistencia a ampicilina. Todo esto evidencia que las células no incorporaron el plásmido pUC19 como era esperado. En adición a la ausencia la cantidad correcta de CaCl2, errores mecánicos de pipeteo, errores humanos y errores aleatorios pudieron haber contribuido a la ausencia de crecimiento bacteriano.

La práctica experimental sirvió para conocer cómo se pueden manipular las células de Escherichia coli para que adquieran material genético exógeno y expresen los genes de ese material incorporado. La técnica utilizada para la transformación fue la química, utilizando CaCl2. Sin embargo, en su experimento, Dower, Miller y Ragsdale (1988) muestran que células de Escherichia coli se pueden transformar de manera extremadamente eficiente utilizando electroporación. Por lo tanto, como el resultado del experimento no fue el esperado ya que no hubo crecimiento bacteriano, en el futuro se puede tratar el mecanismo físico de electroporación para lograr todos los objetivos y poder comparar las eficiencias de ambos mecanismos. Aunque el experimento no fue completamente exitoso, sirvió para entender la transformación y regulación de genes, conceptos sumamente importantes en el campo de la genética.

Referencias

1. Dower, W., Miller J., & Ragsdale, C. (1988). High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16(13), 6127-6145.
2. Lim, G., Lum, D., Ng, B., & Sam, C. (2015). Differential transformation efficiencies observed for pUC19 and pBR322 in E. coli may be related to calcium chloride concentration. Journal of experimental microbiology and immunology, 20(1), 1-6.
3. Noor, R., Islam, Z., Kishore Munshi, S. & Rahman, F. (2013). Influence of temperature on Escherichia coli growth in different culture media. Journal of pure and applied microbiology, 7(2), 899-904.